Вплив трегалози та гліцерину на стійкість до висушування, заморожування-розморожування та осмотичного стресу у рекомбінантних штамів Saccharomyces cerevisiae

Семків, МВ
Тернавська, ОТ
1Дмитрук, КВ
1Сибірний, АА
1Інститут біології клітини НАН України, Львів
Nauka innov. 2018, 14(6):80-92
https://doi.org/10.15407/scin14.06.080
Рубрика: Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України
Мова: Англійська
Анотація: 
Вступ. Пекарські дріжджі Saccharomyces cerevisiae використовують у виробництві хлібобулочних виробів, харчових та кормових добавок, алкогольній ферментації тощо. У біотехнологічних процесах клітини дріжджів зазнають дії значної кількості стресових факторів (висока концентрація цукру та етанолу, підвищена температура, висушування або заморожування тощо), що негативно впливає на їх життєздатність. Дріжджі володіють певними системами захисту від стресу, зокрема накопичення дисахариду трегалози та продукування гліцерину. 
Проблематика. Посилення дії захисних систем дріжджів шляхом збільшення концентрації гліцерину або трегалози може надати більшої стресостійкості штамам S. cerevisiae.
Мета. Конструювання рекомбінантних штамів S. cerevisiae з підвищеним рівнем накопичення трегалози або продукування гліцерину та оцінка стійкості отриманих штамів до низки стресових факторів. 
Матеріали й методи. Трансформацію S. cerevisiae здійснювали методом Li-Ac-PEG. Алкогольну ферментацію здійснювали при температурі 30 °С при перемішуванні зі швидкістю 120 об/хв.
Результати. На основі штаму S. cerevisiae BY4742 було сконструйовано рекомбінантні штами з підвищеним рівнем продукування гліцерину (до 19 г/л). На основі промислового штаму Y-563 як продуцента етанолу було сконструйовано рекомбінантні штами з підвищеним в 3,3 рази внутрішньоклітинним вмістом трегалози. Визначено резистентність отриманих рекомбінантних штамів до різних стресових факторів. Штам BY/TPI25/gpd1gpp2f/fps1 з найвищим рівнем продукції гліцерину виявляв найвищу осмотолерантність. Штами BY/TPI25/gpd1gpp2f, 563/TSL1, 563/TPS1/2 та 563/TPS1/2/TSL1 характеризувалися підвищеною життєздатністю після заморожування-розморожування порівняно з батьківськими штамами, проте не виявляли вищої стійкості до висушування. Рекомбінантний штам 563/TPS1/2/TSL1 з високим вмістом трегалози виявляв вищу активність при зброджуванні цукру в здобному тісті та довше зберігав життєвість при 35 °С, порівняно з батьківським штамом Y-563.
Висновки. Сконструйовані рекомбінантні штами S. cerevisiae можуть бути використані в промислових процесах, що супроводжуються заморожуванням-розморожуванням клітин дріжджів або високим осмотичним тиском у культуральному середовищі. Хлібопекарські дріжджі з підвищеним внутрішньоклітинним вмістом трегалози мають більш тривалий термін зберігання.
Ключові слова: висушування, гліцерол, заморожування-розморожування, осмотолерантність, пекарські дріжджі, трегалоза
Посилання: 
1. Ahmadpour, D., Geijer, C., Tamas, M. J., Lindkvist-Petersson, K., Hohmann, S. (2014). Yeast reveals unexpected roles and regulatory features of aquaporins and aquaglyceroporins. Biochim. Biophys. Acta, 1840(5), 1482-1491.
https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.09.027
2. Albertyn, J., Hohmann, S., Thevelein, J. M., Prior, B. A. (1994). GPD1, which encodes glycerol-3-phosphate dehydrogenase, is essential for growth under osmotic stress in Saccharomyces cerevisiae, and its expression is regulated by the high-osmolarity glycerol response pathway. Mol. Cell Biol., 14(6), 4135-4144.
https://doi.org/10.1128/MCB.14.6.4135
3. Ando, A., Nakamura, T., Murata, Y., Takagi, H., Shima, J. (2007). Identification and classification of genes required for tolerance to freeze-thaw stress revealed by genome-wide screening of Saccharomyces cerevisiae deletion strains. FEMS Yeast Res., 7(2), 244-253.
https://doi.org/10.1111/j.1567-1364.2006.00162.x
4. Attfield, P. V. (1997). Stress tolerance: the key to effective strains of industrial baker's yeast. Nat. Biotechnol., 15(13), 1351-1357.
https://doi.org/10.1038/nbt1297-1351
5. Blomberg, A., Adler, L. (1989). Roles of glycerol and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD+) in acquired osmotolerance of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol., 171(2), 1087-1092.
https://doi.org/10.1128/JB.171.2.1087-1092.1989
6. Blomberg, A., Adler, L. (1992). Physiology of osmotolerance in fungi. Adv. Microb. Physiol., 33, 145-212.
https://doi.org/10.1016/S0065-2911(08)60217-9
7. Brown, A. D. (1978). Compatible solutes and extreme water stress in eukaryotic micro-organisms. Adv. Microb. Physiol., 17, 181-242.
https://doi.org/10.1016/S0065-2911(08)60058-2
8. Byun, S., Lee, E., Lee, K. W. (2017). Therapeutic Implications of Autophagy Inducers in Immunological Disorders, Infection, and Cancer. Int. J. Mol. Sci., 18(9), E1959.
https://doi.org/10.3390/ijms18091959
9. Crowe, J. H. (2007). Trehalose as a "chemical chaperone": fact and fantasy. Adv. Exp. Med. Biol., 594, 143-158.
https://doi.org/10.1007/978-0-387-39975-1_13
10. Eriksson, P., Andre, L., Ansell, R., Blomberg, A., Adler, L. (1995). Cloning and characterization of GPD2, a second gene encoding sn-glycerol 3-phosphate dehydrogenase (NAD+) in Saccharomyces cerevisiae, and its comparison with GPD1. Mol. Microbiol., 17(1), 95-107.
https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1995.mmi_17010095.x
11. Francois, J., Parrou, J. L. (2001). Reserve carbohydrates metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Rev., 25(1), 125-145.
https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2001.tb00574.x
12. Gonchar, M. V., Maidan, M. M., Pavlishko, H. M., Sibirny, A. A. (2001). A new oxidase-peroxidase kit for ethanol assays in alcoholic beverages. Food Technol. Biotechnol., 39, 37-42.
13. Grant, W. D. (2004). Life at low water activity. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 359, 1249-1266; discussion 1266-1247.
https://doi.org/10.1098/rstb.2004.1502
14. Guo, Z. P., Zhang, L., Ding, Z. Y., Shi, G. Y. (2011). Minimization of glycerol synthesis in industrial ethanol yeast without influencing its fermentation performance. Metab. Eng., 13(1), 49-59.
https://doi.org/10.1016/j.ymben.2010.11.003
15. Hohmann, S. (2002). Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66(2), 300-372.
https://doi.org/10.1128/MMBR.66.2.300-372.2002
16. Ishchuk, O. P., Voronovsky, A. Y., Abbas, C. A., Sibirny, A. A. (2009). Construction of Hansenula polymorpha strains with improved thermotolerance. Biotechnol. Bioeng., 104(5), 911-919.
https://doi.org/10.1002/bit.22457
17. Jung, Y. J., Park, H. D. (2005). Antisense-mediated inhibition of acid trehalase (ATH1) gene expression promotes ethanol fermentation and tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Lett., 27(23-24), 1855-1859.
https://doi.org/10.1007/s10529-005-3910-3
18. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. (2010). Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioeng. Bugs., 1(6), 395-403.
https://doi.org/10.4161/bbug.1.6.13257
19. Kim, J., Alizadeh, P., Harding, T., Hefner-Gravink, A., Klionsky, D. J. (1996). Disruption of the yeast ATH1 gene confers better survival after dehydration, freezing, and ethanol shock: potential commercial applications. Appl. Environ. Microbiol., 62(5), 1563-1569.
https://doi.org/10.1128/AEM.62.5.1563-1569.1996
20. Larsson, K., Ansell, R., Eriksson, P., Adler, L. (1993). A gene encoding sn-glycerol 3-phosphate dehydrogenase (NAD+) complements an osmosensitive mutant of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Microbiol., 10(5), 1101-1111.
https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1993.tb00980.x
21. Lee, Y. J., Jeschke, G. R., Roelants, F. M., Thorner, J., Turk, B. E. (2012). Reciprocal phosphorylation of yeast glycerol-3-phosphate dehydrogenases in adaptation to distinct types of stress. Mol. Cell Biol., 32(22), 4705-4717.
https://doi.org/10.1128/MCB.00897-12
22. Londesborough, J., Varimo, K. (1984). Characterization of two trehalases in baker's yeast. Biochem. J., 219(2), 511-518.
https://doi.org/10.1042/bj2190511
23. Luyten, K., Albertyn, J., Skibbe, W. F., Prior, B. A., Ramos, J., Thevelein, J. M., Hohmann, S. (1995). Fps1, a yeast member of the MIP family of channel proteins, is a facilitator for glycerol uptake and efflux and is inactive under osmotic stress. EMBO J., 14(7), 1360-1371.
https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1995.tb07122.x
24. Luzhetskyi, T., Semkiv, M., Dmytruk, K., Sibirny, A. (2015). Improving Thermotolerance of Saccharomyces cerevisiae Industrial Yeast Strain via Derepression of Genes of Trehalose Synthesis. In A. Sibirny, D. Fedorovych, M. Gonchar & D. Grabek-Lejko (Eds.), Living Organisms and Bioanalytical Approaches for Detoxification and Monitoring of Toxic Compounds: Monograph. (pp. 259-268). Rzeszow: University of Rzeszow.
25. Meynial Salles, I., Forchhammer, N., Croux, C., Girbal, L., Soucaille, P. (2007). Evolution of a Saccharomyces cerevisiae metabolic pathway in Escherichia coli. Metab. Eng., 9(2), 152-159.
https://doi.org/10.1016/j.ymben.2006.09.002
26. Norbeck, J., Pahlman, A. K., Akhtar, N., Blomberg, A., Adler, L. (1996). Purification and characterization of two isoenzymes of DL-glycerol-3-phosphatase from Saccharomyces cerevisiae. Identification of the corresponding GPP1 and GPP2 genes and evidence for osmotic regulation of Gpp2p expression by the osmosensing mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Biol. Chem., 271(23), 13875-13881.
https://doi.org/10.1074/jbc.271.23.13875
27. Nwaka, S., Mechler, B., Holzer, H. (1996). Deletion of the ATH1 gene in Saccharomyces cerevisiae prevents growth on trehalose. FEBS Lett., 386(2-3), 235-238.
https://doi.org/10.1016/0014-5793(96)00450-4
28. Oliveira, A. P., Ludwig, C., Picotti, P., Kogadeeva, M., Aebersold, R., Sauer, U. (2012). Regulation of yeast central metabolism by enzyme phosphorylation. Mol. Syst. Biol., 8, 623.
https://doi.org/10.1038/msb.2012.55
29. Overkamp, K. M., Bakker, B. M., Kotter, P., Luttik, M. A., Van Dijken, J. P., Pronk, J. T. (2002). Metabolic engineering of glycerol production in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol., 68(6), 2814-2821.
https://doi.org/10.1128/AEM.68.6.2814-2821.2002
30. Pahlman, A. K., Granath, K., Ansell, R., Hohmann, S., Adler, L. (2001). The yeast glycerol 3-phosphatases Gpp1p and Gpp2p are required for glycerol biosynthesis and differentially involved in the cellular responses to osmotic, anaerobic, and oxidative stress. J. Biol. Chem., 276(5), 3555-3563.
https://doi.org/10.1074/jbc.M007164200
31. Pettersson, N., Filipsson, C., Becit, E., Brive, L., Hohmann, S. (2005). Aquaporins in yeasts and filamentous fungi. Biol. Cell., 97(7), 487-500.
https://doi.org/10.1042/BC20040144
32. Randez-Gil, F., Sanz, P., Prieto, J. A. (1999). Engineering baker's yeast: room for improvement. Trends. Biotechnol., 17(6), 237-244.
https://doi.org/10.1016/S0167-7799(99)01318-9
33. Remize, F., Barnavon, L., Dequin, S. (2001). Glycerol export and glycerol-3-phosphate dehydrogenase, but not glycerol phosphatase, are rate limiting for glycerol production in Saccharomyces cerevisiae. Metab. Eng., 3(4), 301-312.
https://doi.org/10.1006/mben.2001.0197
34. Semkiv, M. V., Dmytruk, K. V., Abbas, C. A., Sibirny, A. A. (2017). Metabolic engineering for high glycerol production by the anaerobic cultures of Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol., 101(11), 4403-4416.
https://doi.org/10.1007/s00253-017-8202-z
35. Tamas, M. J., Luyten, K., Sutherland, F. C., Hernandez, A., Albertyn, J., Valadi, H., Li, H., Prior, B. A., Kilian, S. G., Ramos, J., Gustafsson, L., Thevelein, J. M., Hohmann, S. (1999). Fps1p controls the accumulation and release of the compatible solute glycerol in yeast osmoregulation. Mol. Microbiol., 31(4), 1087-1104.
https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.1999.01248.x
36. Tapia, H., Koshland, D. E. (2014). Trehalose is a versatile and long-lived chaperone for desiccation tolerance. Curr. Biol., 24(23), 2758-2766.
https://doi.org/10.1016/j.cub.2014.10.005
37. ter Linde, J. J., Liang, H., Davis, R. W., Steensma, H. Y., van Dijken, J. P., Pronk, J. T. (1999). Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol., 181(24), 7409-7413.
https://doi.org/10.1128/JB.181.24.7409-7413.1999
38. Wiemken, A. (1990). Trehalose in yeast, stress protectant rather than reserve carbohydrate. Antonie Van Leeuwenhoek, 58(3), 209-217.
https://doi.org/10.1007/BF00548935
39. Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. (1982). Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science, 217(4566), 1214-1222.
https://doi.org/10.1126/science.7112124